Dithiothreitol (DTT) เป็นสารรีดิวซ์ที่ใช้กันทั่วไปหรือที่เรียกว่าสารเติมแต่งสีเขียวชนิดใหม่เป็นสารประกอบอินทรีย์โมเลกุลขนาดเล็กที่มีหมู่เมอร์แคปแทน 2 หมู่ (-SH)เนื่องจากคุณสมบัติและความเสถียรลดลง DTT จึงถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการทดลองทางชีวเคมีและอณูชีววิทยา
บทบาทหลักของ DTT คือการลดพันธะไดซัลไฟด์ในโปรตีนและชีวโมเลกุลอื่นๆพันธะไดซัลไฟด์เป็นส่วนสำคัญของการพับโปรตีนและความเสถียร แต่ภายใต้เงื่อนไขการทดลองบางอย่าง เช่น การวิเคราะห์ SDS-PAGE ที่ลดลง การรวมตัวกันใหม่ของโปรตีนและการพับ จำเป็นต้องลดพันธะไดซัลไฟด์ให้เหลือกลุ่มไทออลสองกลุ่มเพื่อคลี่คลายโครงสร้างเชิงพื้นที่ของ โปรตีนDTT สามารถทำปฏิกิริยากับพันธะไดซัลไฟด์เพื่อลดพันธะให้กลายเป็นหมู่เมอร์แคปแทน ซึ่งจะเป็นการเปิดโครงสร้างเชิงพื้นที่ของโปรตีนและทำให้ง่ายต่อการวิเคราะห์และจัดการ
นอกจากนี้ยังสามารถใช้ DTT เพื่อปกป้องการทำงานของเอนไซม์และความเสถียรอีกด้วยในปฏิกิริยาที่เร่งปฏิกิริยาด้วยเอนไซม์บางชนิด กิจกรรมของเอนไซม์อาจลดลงโดยสารออกซิแดนท์DTT สามารถทำปฏิกิริยากับสารออกซิแดนท์เพื่อลดการเกิดสารที่ไม่เป็นอันตราย จึงช่วยปกป้องกิจกรรมและความคงตัวของเอนไซม์
เมื่อเปรียบเทียบกับสารรีดิวซ์แบบดั้งเดิม เช่น β-mercaptothanolol (β-ME) DTT ถือเป็นตัวรีดิวซ์ที่ปลอดภัยกว่าและมีเสถียรภาพมากกว่าไม่เพียงแต่มีความคงตัวในสารละลายที่เป็นน้ำเท่านั้น แต่ยังรักษาคุณสมบัติรีดิวซ์ไว้ภายใต้สภาวะที่มีอุณหภูมิสูงและกรดเบสอีกด้วย
การใช้ DTT นั้นค่อนข้างง่ายโดยทั่วไป DTT จะถูกละลายในบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม จากนั้นจึงเติมลงในระบบการทดลองความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดของ DTT จะต้องถูกกำหนดตามการทดลองเฉพาะ และโดยทั่วไปจะใช้ในช่วง 0.1-1mMความเข้มข้นที่ต่ำกว่าสามารถลดผลเสียต่อการเจริญเติบโตของเซลล์ และอาจลดความเป็นพิษต่อเซลล์เนื่องจากการแสดงออกมากเกินไปของโปรตีนเป้าหมายความเข้มข้นที่สูงขึ้นอาจทำให้เกิดภาระในการเผาผลาญของเซลล์มากเกินไป ซึ่งส่งผลต่อการเติบโตของเซลล์และประสิทธิภาพการแสดงออก
วิธีระบุความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดคือการประเมินระดับการแสดงออกของโปรตีนเป้าหมายโดยทำการทดสอบการเหนี่ยวนำ IPTG ที่ความเข้มข้นต่างกันการทดสอบการเพาะเลี้ยงขนาดเล็กสามารถทำได้โดยใช้ช่วงความเข้มข้นของ IPTG (เช่น 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM เป็นต้น) และผลการแสดงออกที่ความเข้มข้นต่างกันสามารถประเมินได้โดยการตรวจจับระดับการแสดงออกของโปรตีนเป้าหมาย (เช่น Western การตรวจจับรอยเปื้อนหรือเรืองแสง)จากผลการทดลอง ความเข้มข้นที่มีผลการแสดงออกที่ดีที่สุดถูกเลือกให้เป็นความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุด
นอกจากนี้ คุณยังสามารถอ้างอิงเอกสารที่เกี่ยวข้องหรือประสบการณ์ของห้องปฏิบัติการอื่นๆ เพื่อทำความเข้าใจช่วงความเข้มข้นของ IPTG ที่ใช้กันทั่วไปภายใต้เงื่อนไขการทดลองที่คล้ายคลึงกัน จากนั้นจึงปรับให้เหมาะสมและปรับเปลี่ยนตามความต้องการในการทดลอง
เป็นสิ่งสำคัญที่ต้องสังเกตว่าความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดอาจแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับระบบการแสดงออก โปรตีนเป้าหมาย และสภาวะการทดลองที่แตกต่างกัน ดังนั้นจึงเป็นการดีที่สุดที่จะปรับให้เหมาะสมเป็นกรณีๆ ไป
โดยสรุป DTT เป็นสารรีดิวซ์ที่ใช้กันทั่วไปซึ่งสามารถใช้เพื่อลดพันธะไดซัลไฟด์ในโปรตีนและโมเลกุลชีวภาพอื่นๆ และเพื่อปกป้องการทำงานของเอนไซม์และความเสถียรมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการทดลองทางชีวเคมีและอณูชีววิทยา
เวลาโพสต์: Sep-28-2023