ไดไทโอไทรทอล (DTT) เป็นสารรีดิวซ์ที่ใช้กันทั่วไป หรือที่รู้จักกันในชื่อสารเติมแต่งสีเขียวชนิดใหม่ เป็นสารประกอบอินทรีย์โมเลกุลเล็กที่มีหมู่เมอร์แคปแทน (-SH) สองหมู่ เนื่องจากคุณสมบัติในการรีดิวซ์และความเสถียร DTT จึงถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการทดลองทางชีวเคมีและชีววิทยาโมเลกุล
บทบาทหลักของ DTT คือการลดพันธะไดซัลไฟด์ในโปรตีนและโมเลกุลชีวภาพอื่นๆ พันธะไดซัลไฟด์เป็นส่วนสำคัญของการพับตัวและความเสถียรของโปรตีน แต่ภายใต้สภาวะการทดลองบางอย่าง เช่น การวิเคราะห์ SDS-PAGE ที่ลดได้ การรวมตัวใหม่และการพับตัวของโปรตีน จำเป็นต้องลดพันธะไดซัลไฟด์ให้เป็นหมู่ไทออลสองหมู่เพื่อคลี่โครงสร้างเชิงพื้นที่ของโปรตีน DTT สามารถทำปฏิกิริยากับพันธะไดซัลไฟด์เพื่อลดให้เป็นหมู่เมอร์แคปแทน จึงเปิดโครงสร้างเชิงพื้นที่ของโปรตีนและทำให้วิเคราะห์และจัดการได้ง่ายขึ้น
นอกจากนี้ DTT ยังสามารถใช้เพื่อปกป้องการทำงานและความเสถียรของเอนไซม์ได้ ในปฏิกิริยาที่เร่งด้วยเอนไซม์บางอย่าง การทำงานของเอนไซม์อาจลดลงเนื่องจากสารออกซิแดนต์ DTT สามารถทำปฏิกิริยากับสารออกซิแดนต์เพื่อลดสารเหล่านั้นให้กลายเป็นสารที่ไม่เป็นอันตราย จึงช่วยปกป้องการทำงานและความเสถียรของเอนไซม์ได้
เมื่อเปรียบเทียบกับสารลดแรงตึงผิวแบบดั้งเดิม เช่น β-mercaptoethanol (β-ME) แล้ว DTT ถือว่าเป็นสารลดแรงตึงผิวที่ปลอดภัยและเสถียรกว่า ไม่เพียงแต่มีความเสถียรในสารละลายในน้ำเท่านั้น แต่ยังคงคุณสมบัติในการลดแรงตึงผิวไว้ได้ภายใต้สภาวะอุณหภูมิสูงและสภาวะกรด-เบสอีกด้วย
การใช้ DTT ค่อนข้างง่าย โดยทั่วไป DTT จะถูกละลายในบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม แล้วจึงเติมลงในระบบทดลอง ความเข้มข้นที่เหมาะสมของ DTT จำเป็นต้องกำหนดตามการทดลองเฉพาะ และโดยทั่วไปจะใช้ในช่วง 0.1-1 มิลลิโมลาร์ ความเข้มข้นต่ำสามารถลดผลกระทบที่ไม่พึงประสงค์ต่อการเจริญเติบโตของเซลล์และลดความเป็นพิษต่อเซลล์เนื่องจากการแสดงออกของโปรตีนเป้าหมายมากเกินไป ความเข้มข้นสูงอาจทำให้เซลล์มีภาระทางเมตาบอลิซึมมากเกินไป ส่งผลกระทบต่อการเจริญเติบโตของเซลล์และประสิทธิภาพการแสดงออก
วิธีการกำหนดความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดสามารถทำได้โดยการประเมินระดับการแสดงออกของโปรตีนเป้าหมายโดยการทดสอบการเหนี่ยวนำด้วย IPTG ที่ความเข้มข้นต่างๆ การทดสอบในระดับเพาะเลี้ยงขนาดเล็กสามารถทำได้โดยใช้ความเข้มข้นของ IPTG หลายระดับ (เช่น 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM เป็นต้น) และสามารถประเมินผลการแสดงออกที่ความเข้มข้นต่างๆ ได้โดยการตรวจวัดระดับการแสดงออกของโปรตีนเป้าหมาย (เช่น Western blot หรือการตรวจวัดด้วยฟลูออเรสเซนซ์) จากผลการทดลอง ความเข้มข้นที่มีผลการแสดงออกดีที่สุดจะถูกเลือกเป็นความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุด
นอกจากนี้ คุณยังสามารถอ้างอิงถึงเอกสารที่เกี่ยวข้องหรือประสบการณ์ของห้องปฏิบัติการอื่น ๆ เพื่อทำความเข้าใจช่วงความเข้มข้นของ IPTG ที่ใช้กันทั่วไปภายใต้สภาวะการทดลองที่คล้ายคลึงกัน จากนั้นจึงทำการปรับปรุงและปรับเปลี่ยนให้เหมาะสมกับความต้องการในการทดลอง
สิ่งสำคัญที่ควรทราบคือ ความเข้มข้นที่เหมาะสมอาจแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับระบบการแสดงออก โปรตีนเป้าหมาย และสภาวะการทดลอง ดังนั้นจึงควรปรับให้เหมาะสมเป็นกรณีๆ ไป
โดยสรุปแล้ว DTT เป็นสารรีดิวซ์ที่ใช้กันทั่วไป ซึ่งสามารถใช้ลดพันธะไดซัลไฟด์ในโปรตีนและโมเลกุลชีวภาพอื่นๆ และช่วยปกป้องการทำงานและความเสถียรของเอนไซม์ มีการนำไปใช้กันอย่างแพร่หลายในงานทดลองทางชีวเคมีและชีววิทยาระดับโมเลกุล
วันที่โพสต์: 28 กันยายน 2023